الکتروفورز

الکتروفورز (به انگلیسی: Electrophoresis) به حرکات ذرات در یک مایع تحت میدان الکتریکی گویند.

به سبب اینکه ماکرومولکول‌های زیستی مانند دی‌ان‌ای و پروتئین‌ها باردار هستند می‌توان با قرار دادن آنها در یک میدان الکتریکی، آنها را بر اساس خواص فیزیکی مانند شکل فضایی، وزن مولکولی و بار الکتریکی، تفکیک کرد. برای این منظور از روشی بنام الکتروفورز استفاده می‌شود. روش‌های مختلف الکتروفورزی برای تفکیک و مطالعه بیومولکول‌ها اعم از اسیدهای نوکلئیک یا پروتئین‌ها ابداع شده‌است.

الکتروفورز ژل

از یک محیط نیمه جامد (ژل) به عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. این نوع الکتروفورز برحسب نوع ژل به کار گرفته شده به دو نوع الکتروفورز ژل پلی‌اکریل آمید ( PAGE) و الکتروفورز ژل آگارز تقسیم می‌شود. الکتروفورز PAGE دارای قدرت تفکیک بسیار بالائی بوده و برای تفکیک پروتئین‌ها و اسیدهای نوکلئیک به کار گرفته می‌شود. به منظور بررسی پروتئین‌ها با استفاده از PAGE، به سبب اینکه پروتئین‌ها دارای بار مختلف هستند، معمولاً برای اینکه تفکیک فقط براساس وزن مولکولی انجام شود به بافر ماده شیمیائی SDS (سدیم دو دسیل سولفات ) اضافه می‌شود. SDS مولکول بزرگی با بار منفی می‌باشد. این ماده باعث واسرشت شدن پروتئین‌ها شده و به آنها متصل می‌شود. به ازای هر دو اسید آمینه، یک مولکول SDS به پروتئین متصل می‌شود که باعث القاء بارمنفی متناسب با وزن مولکولی به پروتئین می‌شود. هر چه غلظت پلی اکریل آمید بیشتر باشد قدرت تفکیک ژل بیشتر خواهد بود و مولکول‌های دارای وزن مولکولی نزدیک به هم را بهتر تفکیک می‌نماید.

برای تفکیک اسیدهای نوکلئیک در صورت امکان از ژل آگارز استفاده می‌شود. تهیه ژل مزبور به مراتب سریعتر وآسانتر از ژل پلی اکریل آمید بوده و هزینه کمتری را در بر می‌گیرد. معمولاً برای تفکیک قطعات بزرگ DNA (بزرگ‌تر از ۵۰۰ جفت باز) در صورتیکه هدف صرفاً بررسی کیفی و تفکیک باشد استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است. برای تفکیک قطعات کوچک DNA دو رشته‌ای و قطعات DNA تک رشته‌ای از ژل پلی اکریل آمید استفاده می‌شود. قدرت تفکیک ژل‌های مزبور ارتباط مستقیمی با غلظت آنها دارد. برای مثال، برای تفکیک قطعاتی به اندازه ۱۰۰ جفت باز از آگاروز ۳٪ و برای قطعات حدود ۲۰۰۰ جفت باز از آگارز ۸/۰ ٪ استفاده می‌شود. در صورتیکه نیاز به تفکیک DNA به صورت تک رشته‌ای باشد، از مواد واسرشت کننده نظیر اوره، فرمالدهید یا فرمامید در ژل هم‌زمان با الکتروفورز استفاده می‌شود. به این نوع ژل‌ها، ژل واسرشت کننده می‌گویند. چنین ژل هائی پیچ و تاب‌های اسیدهای نوکلئیک را از هم باز کرده و بنابراین تفکیک مولکول‌ها فقط براساس طول و نه ساختار دوم انجام می‌شود. در این ژل‌ها مولکول‌های کوچک‌تر در مقایسه با مولکول‌های بزرگ‌تر سریعتر حرکت کرده و مسافت بیشتری را طی می‌کنند. از روش PAGE برای بررسی جهش‌ها و تعیین توالی دی‌ان‌ای استفاده می‌شود 

جداسازی توسط الکتروفورز تحت تاثیر عوامل متعددی قرار دارد. ماهیت مولکولهای نمونه نظیر بار الکتریکی و اندازه آنها و شدت جریان و میدان الکتریکی و بالاخره اثرات محیطی نظیر نوع و نحوه ی استفاده از بافرها و حرارت ایجاد شده در حین کار عواملی هستند که بر نحوه ی جداسازی مولکولهای نمونه اثر می گذارند.

۵-۱-۱-۱-  اثر عوامل الکتریکی

در الکتروفورز سرعت حرکت مولکول ها تناسب مستقیم با اختلاف پتانسیل اِعمال شده دارد. قانون اُهم  Ohm در الکتروفورز از اهمیت زیادی برخوردار است (معادله ۵-۱)

V=IR

معادله ۵-۱- قانون اهم؛ V ولتاژ یا اختلاف پتانسیل برحسب ولت, I شدت جریان بر حسب آمپر و R مقاومت بر حسب اُهم است

معادله فیزیکی دیگر که از آهمیت برخوردار است, معادله توان است. این معادله مقدار حرارت ایجاد شده در حین الکتروفورز را مشخص می کند.

P=V^۲/R یا P=I^۲R یا P=VI

معادله ۵-۲- معادله توان که در آن P توان بر حسب وات است.

این حرارت ایجاد شده بر اثر مقاومتی است که الکترودها, بافر مورد استفاده, و ژل دارند و به گرمای ژول Joule heat موسوم است. منابع الکتریکی Power supply مورد استفاده در الکتروفورز ایجاد جریان مستقیم می کنند و معمولا" یکی از پارامترهای الکتریکی,یعنی یاجریان یا اختلاف پتاتسیل یا توان را ثابت نگاه می دارند. باید توجه داشت که مقاومت مدار مورد استفاده در الکتروفورز را به هر حال نمی توان ثابت نگاه داشت. برای مثال در حین الکتروفورز, مقاومت بافر بر اثر گرمای ژول, کاهش می یابد. بنا بر نوع بافر بکار رفته و پارامتر الکتریکی که ثابت نگاه داشته می شود, گرمای ژول در حین انجام الکتروفورز ممکن است کاهش یا افزایش یابد (جدول ۵-۱). برای مثال در "SDS-PAGE" ناپیوسته ثابت نگاه داشتن شدت جریان منجر به افزایش دما می شود که نیاز به سیستم خنک کننده را در چنین وضعیتی الزامی می کند. 

منابع

انتخاب نوع پارامتر ثابت در منبع الکتریکی در حین الکتروفورز, با در نظر گرفتن متغیر های مختلفی صورت می پذیرد. برای مثال مدت زمان مورد نظر برای انجام الکتروفورز, الزام به حداقل رساندن انتشار نمونه و مقدار از دست دادن فعالیت نمونه که بر اثر حرارت و در طول زمان رخ می دهد, و نیاز به حفظ دمای خاص برای انجام الکتروفورز. معمولا" پروتئین ها با جریان ثابت الکتروفورز می شوند, در حالیکه الکتروفورز اسید های نوکلئیک با ولتاژ ثابت انجام می شود.

۵-۱-۱-۱- اثر سیستم های بافری و pH

پروتئین ها به علت خصوصیت آمفوتری خود تحت تاثیر pH  محیطی که در آن قرار داشته باشند بارالکتریکی خاص خود را نشان می دهند. بدین ترتیب در جداسازی توسط الکتروفورز باید pH  محلول های  مورد استفاده ثابت باقی بماند از آنجا که الکترولیز آب در آنود یونهای "H⁺" و در کاتود یونهای "OH^-" ایجاد می کند, برای ثابت نگاه داشتن pH محلولهای مورد استفاده, آنها باید بافر شوند.

۵-۱-۱-۲- اثر حرارت

برای حفظ تکرار پذیری, ثابت نگاه داشتن حرارت در تمام مراحل الکتروفورز بسیار مهم است. برای مثال پلی مریزه شدن آکریل آمید یک واکنش گرمازا است, از اینرو گرمای ایجاد شده در حین پلی مریزاسیون, به خصوص در مورد ژل های غلیظ تر, ممکن است با انتقال گرما باعث بروز بی نظمی در اندازه ی منافذ ژل گردد. انتقال گرما معمولا" مشکلی در ژل هایی با غلظت کمتر از ۱۵% T نمی کند. به هر حال گرمای زیاد در حینالکتروفورز مشکلات دیگری را نیز پدید می آورد؛ شکستن شیشه های الکتروفورز, آسیب به دستگاه. وقتیکه حرارت بصورت یک دست در تمام نقاط ژل نباشد شکل باندهای جدا شده نامنظم » شود و در اصطلاح باندها خندان می شوند چون نمونه ها در ردیف های وسط سریع تر از ردیف های کناری حرکت خواهند کرد.

۵-۲-      الکتروفورز با ژل پلی آکریل آمید

اکثر روش های مربوط به تفکیک پروتئین ها که امروزه از آنها استفاده می شود بر مبنای الکتروفورز منطقه ای یا ناپیوسته ژل های پلی آکریل آمید استوار است . الکتروفورز منطقه ای  روی ژل پلی آکریل آمید تحت عنوان "PAGE" شناخته می شود. در این روش از تفاوت وزن مولکولی و بارالکتریکی پروتئین ها به طور همزمان برای تفکیک آنها از یکدیگر استفاده می شود.

اساس این روش بر مبنای حرکت مولکولهای باردار در یک میدان الکتریکی مشخص است. مشخصات میدان الکتریکی نظیر اختلاف پتانسیل، فاصلة بین الکترودها ، مشخصات مولکول نظیر بار الکتریکی, اندازه و شکل مولکول ، و عوامل دیگری نظیر دما و زمان بر نحوه ی انجام این روش تاثیر می گذارند.

درسیستم ناپیوسته "Laemmli" دو نوع ژل وجود دارد: ژل ردیف کننده و ژل تفکیک کننده Resolving  ژل ردیف کننده ژلی با طول کم و با منافذ بزرگ است که در بالای ژل بلند و با منافذ کوچک تفکیک کننده قرار می گیرد. در سیستم "Laemmli" ژلهای ردیف کننده و تفکیک کننده با تو جه به ترکیب بافریشان نیز ناپیوسته اند.

این دو پارامتر ; بافرهای متفاوت و ترکیب آکریل آمید متفاوت به نمونه هایی با حجم نسبتاً بزرگ این اجازه را می دهد که در بخش بالای ژل ردیف کننده متمرکز شوند پیش از آنکه بواسطة ورود به ژل پائینی تفکیک کننده عمل جداسازی رویشان انجام گیرد.

مزیت مهم ژل ردیف کننده توانایی آن در تمرکز پروتئین نمونه های بسیار رقیق است . این کار بطور مؤثری تفکیک مراحل بعدی را بهبود می بخشد چراکه نمونة اصلی در ناحیة خیلی باریک و بسیار متمرکزی جمع می شود و همة مولکولهای پروتئینی جداسازی الکتروفورتیک خود را تقریباً از یک نقطه شروع می کنند.

ردیف شدن  ناشی از ایجاد یک گرادیان محدودو با ولتاژ بالا است که در آن پروتئین ها مقید به یک ناحیة باریک کاملاً متمرکز بین یونهای کلراید پیشتاز و گلایسین دنباله رو می شوند. وقتی جریان الکتریکی از نمونه عبور می کند، یون کراید از سایر یونها که حرکت آرامتری دارند ( مثلاً گلایسین ) سریعتر مهاجرت می کند. یون های نمونه با حرکت حد واسط خود بین یونهای کلرید و گلایسین کمپرس شده و در نتیجه  یک ناحیة باریک یا باندی شکل بسیار متمرکز ایجاد می شود. بنابراین ژل ردیف کننده قادر است  پروتئین ها را بصورت باندی باریک ساندویچ کند. برای انجام جداسازی الکتروفورتیک، پروتئین ها بعد از انباشته شدن روی یکدیگر از آن محدوده جدا شوند. تفکیک بدون ردیف کردن و با با افزایش ناگهانی pH و کاهش قطرحفرات ژل نیز امکان پذیر است . تحت این شرایط ، یونهای نمونه به ژل تفکیک کننده مهاجرت کرده و یونهای عقب دنباله رو ( گلایسین ) متناوباً از یونهای نمونه پیشی گرفته و جلو می زنند. بنابراین گرادیان ولتاژ نسبتاً ثابتی ایجاد می شود که در آن جداسازی الکتروفورتیک نمونه رخ می دهد.

۵-۲-۱-     نحوه ی ایجاد منافذ با اندازه های متفاوت

ژل پلی آکریل آمید محدودة گسترده ای از اندازه های حفرات ژلی را دربر می گیرد .

 

پلیمریزاسیون آکریل آمید و بیس آکریل آمید می تواند به صورت شیمیایی, با  تترامتیل اتیلن دیامین N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED) و آمونیوم پرسولفات, یا سیستم فتوشیمیایی باشد.

رادیکالهای آزاد پرسولفات که با حل آمونیوم پرسولفات در آب ایجاد می شوند مونومر آکریل آمید را فعال کرده و "TEMED" در این واکنش با انتقال الکترون این واکنش را کاتالیز می کند . در عین حال ریبوفلاوین می تواند در حضور اکسیژن و اشعة UV رادیکال آزاد تولید کند . بعضی مواقع از ریبوفلاوین و آمونیوم پرسولفات برای ایجاد رادیکالهای آزاد استفاده می شود.

اندازة منافذ ژل عامل اصلی در تعیین قدرت تفکیک پروتئین ها و پلی پپتیدها در ژلهای پلی آکریل آمید است. اندازه ی منافذ با دو پارامتر مشخص می شوند: محتوای کل ماده ی جامد یا %T ونسبت مونومر ایجاد کننده ی پیوند متقاطع به مونومر آکریل آمید یا %C.

بدین ترتیب پلیمرهای آکریل آمید می توانند منافذی با اندازه های بسیار متفاوتی را ایجاد کنند. با تغییر در غلظت آکریل آمید و نسبت اتصالات متقاطع کنترل اندازه ی منافذ امکان پذیر است. برای مثال، با افزایش نسبت پیوندهای متقاطع ، اندازه ی منافذ کاهش می یابد. انتخاب دقیق و درست غلظت ژل آکریل آمید برای جداسازی بهینه پروتئین ها در الکتروفورز ضروری است(جدول ۵-۲(.

محدوده اندازه ی مولکولی قابل تفکیک (kD)	درصد آکریل آمید در ژل
۲۰۵-۳۶	۵%
۲۰۵-۲۴	۵/۷%
۲۰۵-۱۴	۱۰%
۶۶-۱۴	۱۲%
۴۵-۱۴	۱۵%

جدول ۵-۲- در صد آکریل آمید برای جداساژط پروتئین هایی با اندازه های مختلف

نکات دیگری نیز در نحوه ی پلی مریزه شدن موثرند, برای مثال با افزایش دمای پلیمریزاسیون، میزان پلیمریزاسیون افزایش می یابدو اندازه ی منافذ ژل کوچک می شود. درحالیکه کاهش دمای پلیمریزاسیون می تواند ژلهایی با منافذ بزرگ تولید کند. عواملی که کارایی تبدیل مونومر به پلی مر را تحت تأثیر قرار می دهند نیز می توانند اندازة حفرة ژل را تحت تأثیر قرار دهند. برای مثال ، استفاده از آکریل آمید کیفیت پائین و نیز pH بسیار بالا یا پایین سبب تبدیل ناکامل مونومر به پلی مر شده و سبب ایجاد منافذ بزرگی در ژل شود. مواد افزودنی ژل نیز می تواند بطور قابل توجهی ساختار منافذ ژل را تحت تأثیر قرار دهدمثلاً اوره ۸ مولار سبب ایجاد ژلهایی با منافذ کوچک می شود, چون سبب تسهیل پلیمریزاسیون کامل می شود.

 

   SDS-PAGE پروتئین ها

سدیم دودسیل سولفات"SDS" یک دترجنت آنیونی است که به اغلب مولکولهای پروتئینی در محلول های مایی و درpH  های متفاوت متصل می شود. "SDS" تقریبا" به همه ی پروتئینها با نسبت تقریبی ۴/۱ گرم در ۱ گرم پروتین اتصال می یابد. برای همین "SDS"  باعث القاء بار الکتریکی منفی متناسب با اندازه در پلی پپتیدها میگردد. علاوه بر این "SDS" با تخریب پیوندهای هیدروژنی و بر هم کنش های هیدروفوبی, باعث تخریب ساختمان دوم و سوم پروتئین ها می گردد. در صورت حضور یک ماده ی احیا کننده نظیر "DTT"  پیوندهای دی سولفیدی از گسسته وتاخوردگی پروتئین ها به طور کامل از بین می رود. پلی پپتیدهایی که شکل طبیعی اشان توسط "SDS"  بر هم خورده و احیا هم شده اند به شکل میله هایی انعطاف پذیر در می آیند که دارای بار منفی یک دست در واحد طول خود هستند. از آنجا که نسبت بار الکتریکی به جرم مولکولی در این پلی پپتیدها تقریبا" نسبتی مشابه است, جداسازی پروتئین ها در الکتروفورز تحت چنین شرایطی تقریبا" به طور کامل وابسته به تفاوت در وزن مولکولی آنها است.

برخی پروتئین ها در "SDS-PAGE" رفتاری غیرعادی دارند به خصوص برخی گلیکوپروتئین ها به مقادیر عادی از "SDS" متصل نمی شوند, در نتیجه نسبت بار الکتریکی به وزن مولکولی در آنها مشابه این نسبت در پروتئین های دیگر نیست و مهاجرت آنها کمتر بوده در نتیجه وزن مولکولی بیشتری از خود نشان خواهند داد.

پروتئین هایی با بارمنفی زیاد و یا با  بار مثبت زیاد, مثلا" هیستون ها, یا پروتئین های غنی از پرولین, مثلا" کلاژن, در مجاورت "SDS" بطور غیرطبیعی وزن مولکولی بالایی از خود نشان می دهند.

ّبه هرحال، "SDS-PAGE" در جداسازی پروتئین هایی با جرم مولکولی خیلی مشابه که دارای تغییرات بعد از ترجمه, نظیر استیلیشن یا متیلیشن یا فسفروریلیشن, هستند از ارزش کمی برخوردار است. برای آنالیز چنین پروتئین های تغییر یافته ای ، از روش PAGE با اوریک اسید استفاده می شود که در آن هم وزن مولکولی و هم بار پروتئین در فرآیند جداسازی دخیل است . پروتئین در pH اسیدی بار مثبت دارد و در میدان الکتریکی به سمت کاتد حرکت می کند . به این دلیل از روش PAGE اسیداوره عموماً برای جداسازی پروتئین هایی با سایز یکسان و بار متفاوت استفاده می شود.

 

مشکلاتی که ممکن است درحین آماده سازی و کار با ژلSDS بوجود آید:

 

             

مشکل	علت	چارة کار
کاهش میزان پلیمریزاسیون ژل	وجود اکسیژن ، کهنه بودن محلولهای استوک  ( بخصوص آکریل آمید و امونیوم پرسولفات )	محلولها را degas کنید. مجدداً محلول استوک تهیه کنید .
تشکیل انتهای چسبنده ژل	نفوذ n-butanol به ژل.	محلول ژل را با n- بوتانل بپوشانید بدون اینکه مخلوطشان کنید .
نارضایتی از نتیجه رنگ آمیزی، رنگ آمیزی ضعیف	رنگ بطور مطلوب باند با نمونه نشده است	از محلول غلیظ تر رنگ استفاده کنید . زمان رنگ‌آمیزی را افزایش دهید و یا از رنگی با حساسیت بالا استفاده کنید. محلول رنگی می بایستی حاوی محلول ارگانیک ( مثل متانول ) باشد که SDS را از پروتئین جدا کند چراکه ممکن است رنگ به آن بچسبد .
رنگ یکدست نیست	نقوذ رنگ و یا رنگ بری بصورت یکدست انجام نشده است .	ژل را درطی رنگ آمیزی و رنگ بری تکان دهید . زمان رنگ آمیزی و رنگ بری را افزایش دهید .
باندها رنگ نگرفته اند .	رنگ پروتئین حذف شده است.	ژل را مجدداً رنگ کنید . زمان رنگ بری را کم کنید و یا از رنگی استفاده کنید که پروتئین را طوری رنگ کند که رنگش محو نشود ..
بر روی ژل نشانه هایی از رنگ در نواحی غیراختصاصی مشاهده می شود	درمحلول رنگی ، رنگ به صورت جامد و حل نشده باقی مانده و مشاهده  می شود .	از حل شدن کامل رنگ اطمینان حاصل کرده یا اینکه رنگ را پیش از استفاده فیلتر کنید .
آلودگی بطور وضوح مشاهده می شود .	وسایل و یا محلولهای استوک آلوده هستند . مواد غیرپروتئینی در نمونه رنگ گرفته اند ( به عنوان مثال اسیدنوکلئیک )	وسایل را تمیز کرده یا از وسایل نو استفاده کنید. از رنگ دیگری استفاده کنید که آلودگی ها را رنگ ننماید .
تفکیک باندهای پروتئینی بخوبی انجام نگرفته است .	الکتروفورز ناکارآمد . سایز Pore (‌حفره ) ژل جداکننده مناسب نیست . میزان load شده تا میزان زیادی عوض شده است	درصد C و T ژل جداکننده را تغییر دهید . هربار از میزان Loading یکسانی استفاده کنید .
هر از گاهی تغییرات جزئی درحرکت الکتروفورتیک پروتئینهای استاندارد مشاهده می شود .	اجزاء سازنده ژل به لحاظ کیفی از Batch به Batch دیگر با گذشت زمان تغییر می کند .	از یک Batch ماده شیمیایی تا حداکثر زمان ممکن استفاده کنید و محلولهای Stock دترجنت های کهنه را عوض کنید .
کج و معوج شدن باندها ، باندها پخش یا رگه دار شده باشد .	پروتئینهای نمونه در حلال غیرقابل حلند ، یا بصورت مجتمع aggregate باقی مانده اند . یک عامل حل نشده است یا حباب موجود در ژل با باند پروتئینی درحال حرکت درگیر شده است .	از حلال تازه با SDS اضافی و عوامل کاهنده  استفاده کنید بخصوص برای محلولهای مربوط به نمونه تغلیظ شده . محلول Stock را پیش از استفاده فیلتر کنید و هرگونه حبابی را از ژل خارج کنید .
مهاجرت پروتئینی یکپارچه نیست ( باندها خم می شوند )	سایز حفرات ژل یکسان نیست . بخشی از ژل درگیر نشده است . نشت الکتریکی (برق دزدی). خنک کردن ژل یکپارچه نیست ( در نتیجه یک بخش سریعتر از بخش دیگر حرکت می کند ) .	مطمئن شوید که محلولهای ژلی بخوبی مخلوط شده اند و پلیمریزاسیون خیلی به سرعت انجام گرفته ( برای کاهش زمان پلیمریزاسیون پرسولفات را کاهش دهید . قبل از الکتروفورز هر حبابی را که به ژل چسبیده حذف کنید . مطمئن شوید که اسپیسهای کناری درجای مناسب قرارگرفته اند . سیستم خنک کننده ژل را بهبود بخشید یا میزان گرما را با کاهش ولتاژ یا قدرت یونی بافر کاهش دهید .

 

۶-  روش های آشکارسازی پروتئینها بر روی ژل های دو بعدی :

 

روشهای آشکارسازی پروتئینها بر روی ژلهای دوبعدی را می توان به ۵ نوع اساسی تقسیم کرد:

• رنگ آمیزی با رنگهای آنیونیک نظیر کوماسی بلو
• رنگ آمیزی منفی با کاتیونهای فلزی مثل رنگ آمیزی زینک یا روی
• رنگ آمیزی Silver یا نقره
• فلورسانس
• ایزوتوپهای رادیواکتیو با استفاده از اتورادیوگرافی ، فلوروگرافی یا فسفرو ایمیجینگ

در اغلب این روشهای رنگ آمیزی پلی پپتید های تفکیک شده باید حداقل چند ساعت درمحلولی حاوی اتانول, استیک اسید و آب تثبیت شوند.

۶-۱-      رنگ آمیزی آبی کوماسی و ایمیدازول

روش انتخابی برای رنگ آمیزی ژل پس از انجام ۲D-PAGE بستگی به طبیعت نمونه اولیه و هدف آزمایش دارد. برای شناسایی پروتئین ها با استفاده از ژل های Preparative و طیف سنجی جرمی یک روش رنگ آمیزی قابل برگشت مورد نیاز است. رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید با آبی کوماسی یا ایمیدازول - روی نتایج مطلوبی بدست می دهد که با روشهای طیف سنجی جرمی سازگار است

آبی کوماسی اساساً اولین بار برای رنگ آمیزی اسیدی پشم تهیه شد. دو گونه ی مختلف از این رنگ وجود دارد که به نامهای آبی کوماسی G-۲۵۰ و R-۲۵۰ شناخته می شوند و به ترتیب دارای ته رنگ سبز و قرمز هستند. عدد ۲۵۰ نیز معرف قدرت رنگ است که اولین بار توسط تولید کنندة آن Imperial Chemical Industries مورد استفاه قرارگرفت. اگر چه این شرکت دیگر رنگ را تولید نمی کند ولی علامت تجاری این محصول به آن تعلق دارد. روش رنگ آمیزی رایج ژلهای پلی آکریل آمید با آبی کوماسی که در ترکیب با اسید استیک و متانل بکار می رود، سالهاست که مورد استفاده قرار می گیرد. رنگ کوماسی آبی G-۲۵۰ با اسیدهای آمینه قلیایی از جمله آرژی نین ، تیروزین ، لیزین و هیستیدین ایجاد کمپلکس می کند. اما رنگ شدید زمینه و متعاقب آن نیاز به مراحل متعدد رنگ زدایی از نکات منفی این روش است.

روش رنگ آمیزی ایمیدازول - روی که توسط Ortiz و همکارانش ابداع شد یک روش رنگ آمیزی نگاتیو است که در آن زمینه ی ژل به جای پروتئین ها رنگ می شود. در این روش در مناطقی از ژل که حاوی پروتئین نیستند, کمپلکسی از "SDS" و ایمیدازول روی رسوب میکنند, که یک زمینه ی سفید کدر روی ژل ایجاد می کند. مناطقی از ژل که حاوی پروتئین هستند شفاف باقی می مانند. این روش رنگ آمیزی به حساسیت روش نقره است و تنها نیم ساعت طول می کشد. علاوه بر این ، نیازی به تثبیت پروتئین ها در ژل وجود ندارد. برهم کنشی بین رنگ و پروتئین وجود ندارد ودر صورت نیاز، ژل را کاملاٌ می توان رنگ زدایی کرد. در اینجا هر دو روش شرح داده می شود . این روشها را برای ژلهای ۲-D آنالیتیکال و ژلهای SDS-PAGE هم می توان بکار برد. برای ژلهای نازک تر ( کمتر از یک میلی متر ) زمان انکوباسیون در روش ایمیدازول- روی را می توان کاهش داد.

همة محلولها باید در ظروف شیشه ای و با آب مقطر دیونیزه تهیه شوند. محلولهای رنگ آمیزی آبی کوماسی G-۲۵۰ عبارتند از محلول تثبیت کننده و محلول رنگ آبی کوماسی G-۲۵۰. محلول های روش رنگ آمیزی منفی ایمیدازول-روی عبارتند از محلول کربنات سدیم، محلول ایمیدازول SDS ،محلول استات روی. هرگونه ذرات معلق باید توسط کاغذ فیلتر Whatman شماره ۱ صاف شود. در این روش ها تمام محلول ها و ژلها باید با دستکش کار شوند و تمام مراحل کار در دمای اتاق و در ظروف رنگ آمیزی و روی شیکر^[۱] انجام شود.

در روش رنگ آمیزی با آبی کوماسی G-۲۵۰, تثبیت ژل بلافاصله پس از الکتروفورز انجام می شود. با این وجود باید توجه داشت که مرحله تثبیت کردن در این روش رنگ آمیزی یک ضرورت نیست.

مرحله تثبیت ژل در روش ایمیدازول-روی ضروری نیست و ژلها بلافاصله پس از الکتروفورز رنگ آمیزی می شوند. برای مشاهده ی بهتر، رنگ آمیزی ژل در یک زمینه تیره برای تشخیص نحوه ی ظهور رنگ ایده آل خواهد بود. هنگامی که وضوح مطلوب بر روی ژل مشاهده شد پروتئین ها بصورت مناطق شفاف در یک زمینة مات سفید خود را نشان می دهند.

 نکته ها :

• رنگ آمیزی با آبی کوماسی R-۲۵۰ با روشهای طیف سنجی جرمی سازگاراست.
• تفاوتهایی در حساسیت و زمان رنگ آمیزی روشهای شرح داده شدة فوق وجود دارد. تجربه نشان داده است که حساسیت روش رنگ آمیزی ایمیدازول روی به اندازة روش نقره است (۱۰-۱ نانوگرم BSA ) و حدود نیم ساعت طول می کشد. در بین روشهای فوق ، روش رنگ آمیزی منفی از همه سریعتر و حساستر است. اما این ژلها اندکی شکننده تر بنظر می رسند و درصورت نگهداری طولانی مدت مستعد خشک شدن هستند. ضمناً برای مشاهده نیاز به زمینة تیره دارند. روش استاندارد کوماسی R-۲۵۰ از بقیه حساسیت کمتری دارد و الکل زیادی نیز مصرف می کند.
• اگر با ژل ها با ملایمت رفتار نشود ترک می خورند و می شکنند. اگر چنین اتفاقاتی برای ژل زیاد روی می دهد اکریل آمید را با دورآکریل^[۲] جایگزین کنید.
• ظرف رنگ آمیزی باید به گونه ای انتخاب شود که اندکی بزرگتر از ژل باشد. ژلها به ویژه ژلهای بزرگ، باید در ظروف جداگانه رنگ آمیزی شوند. ظروف پلاستیکی مناسب برای رنگ آمیزی ارجحیت دارند اما ظروف شیشه ای نیز مناسب هستند .
• طیف سنجی پپتیدی و طیف مربوط به ترادف پپتیدها را با کیفیت خوبی می توان از پروتئین بدست آمده از یک الی چهار نقطه بدست آمده از ژلهای مشابهی که با هرکدام از روشهای رنگ آمیزی گفته شده در این بخش رنگ شده باشند بدست آورد. آبی کوماسی را می توان در طی هضم داخل ژل توسط تریپسین، با کمک حلالهای آلی از بین برد. تکه ژلهایی که توسط ایمیدازول- روی رنگ آمیزی شده اند را می توان پیش از قراردادن در معرض تریپسین، توسط اسید سیتریک ۲% رنگ زدایی کرد. البته این کار ضروری نیست . باید توجه نمود که رنگ آمیزی نقره نیز با اعمال تغییراتی می تواند با طیف سنجی جرمی سازگار شوند.

۶-۲-      روش رنگ آمیزی کوماسی کلوئیدی:

در سال ۱۹۸۵ Neuhoff روشی حساس برای رنگ آمیزی پروتئین در ژلهای آکریلامید بر پایة ویژگی کلوئیدی آبی کوماسی G-۲۵۰ ارائه کرد. این روش درکمتر از یک ساعت پروتئین ها را در یک زمینه تمیز و با حساسیتی درحدود روش نقره رنگ آمیزی می کند. این روش بعداً توسط همان گروه بهبود یافت.

افزودن متانل و سولفات آمونیوم به محلولی از آبی کوماسی G-۲۵۰ در اسید فسفریک رقیق، رنگ مذکور را به سمت شکل کلوئیدی آن سوق می دهد. در طی رنگ آمیزی، تعادلی بین اشکال کلوئیدی وفرم پراکنده مولکولی رنگ وجود دارد. فرم پراکنده رنگ وارد ماتریکس ژل می شود و پروتئین ها را رنگ می کند. حال آنکه فرم کلوئیدی بیرون نگه داشته می شود و به این ترتیب از رنگ آمیزی زمینه پرهیز می شود.

پروتکل های متعددی برای رنگ آمیزی با کوماسی و نیز تعداد مختلفی رنگ کوماسی وجود دارد. این روشها سریع و ارزان هستند هرچند که مرحله تهیه رنگ می تواند اندکی همراه با آلودگی با رنگ باشد. بهتر است محلول رنگ را به فواصل زمانی مشخصی تجدید کرد چون رنگ کهنه حساسیت خود را از دست می دهد. همچنین می توان محلولهای آماده رنگ را البته با قیمت بیشتر خریداری کرد. اغلب شرکتهایی که این رنگها را تولید می کنند ادعا می کنند که این رنگها از رنگهای کوماسی مرسوم حساستر هستند و رنگ زدایی کمتر احتیاج دارند و بعلاوه ، مواد غیر پروتئینی از جمله پلی ساکاریدها را هم رنگ می کند.

تمام مراحل کار روی یک  شیکر چرخان با دور ملایم انجام می شوند. بدنبال الکتروفورز، ژل را در محلول رنگ کوماسی کلوئیدی قرار می گیرد. محلول رنگ را پیش از استفاده نباید صاف کرد. ژل حدود ۶ ساعت یا شب تا صبح درمحلول رنگ قرار داده می شود. در انتها ژل چندین بار با آب مقطر شسته می شود تا زمینة ژل شفاف شود .

۶-۳-      رنگ آمیزی نیترات نقره

رنگ آمیزی نقره ژلهای پلی آکریل آمید اولین بار در سال ۱۹۷۹ توسط Switzer و همکارانش، معرفی شد، و به دلیل حساسیت بالای آن به سرعت عمومیت پیدا کرد. حساسیت این روش حدودا" صد بار بیشتر از روش رنگ آمیزی با آبی کوماسی است. با این وجود، دستورالعمل های اولیه رنگ آمیزی نقره خالی از اشکال نبودندو رنگهای پس زمینه روی ژل و متعاقباً کاهش حساسیت و کاهش تکرارپذیری مکرراً تجربه می شد.

این موضوع منجر شد به اینکه بسیاری از نویسندگان پروتوکل های اصلاح شده ای را پیشنهاد کنند بنحوی که امروزه بیش از یکصد پروتوکل مختلف برای رنگ آمیزی نقره در منابع علمی یافت می شود. با این وجود ، تمام این روشها بر پایه اصول مشترکی قرار دارند

مرحله اول عبارتست از تثبیت یا fixation و هدف آن غیرمحلول نمودن پروتئین ها در درون ژل و نیز شستن ترکیبات تداخل کننده ای است که در ژلهای ۲-D وجود دارند, از جمله گلایسین ، تریس ، SDS و کریرآمفولایت هایی که در ته ژلها وجود دارند.

مرحله دوم حساس نمودن است و هدف از این مرحله افزایش دادن امکان ظهور نقاط در مراحل بعدی است. ترکیبات بی شماری برای این منظور پیشنهاد شده اند. تمام این ترکیبات به پروتئین ها متصل می شوند و همچنین قادرند که به یون نقره متصل شوند و یا اینکه یون نقره را به نقره فلزی یا سولفید نقره تبدیل کنند. مرحله حساس نمودن گاهی با مرحله فیکس کردن همزمان  انجام می شود.

مرحله سوم اضافه کردن  نقره است که در این مرحله می توان از نیترات نقره ساده یا نقره آمونیاکی استفاده کرد.

مرحله چهارم و آخر عبارتست از ظهور ژلهایی که در نیترات نقره غوطه ور بوده اند. محلول ظهور حاوی فرم آلدئید ، کربنات و تیوسولفات است. استفاده از ترکیب اخیر که توسط Blum و همکاران معرفی شده است باعث کاهش قابل ملاحظه ای در پس زمینه و نیز ظهور کامل تصویر می شود. در ژلهایی که در محلول نقره آمونیاکی بوده اند محلول ظهور باید حاوی فرمالدئید و اسیدسیتریک باشد. برای کاهش رنگ زمینه همچنین می توان ژل را پیش از مرحله ظهور مختصراً در تیوسولفات قرار داد  یا اینکه آنرا درمحلول ظهور لحاظ کرد. زمانی که حدمطلوب ظهور تصویر بدست آمد، با قراردادن ژن در محلول متوقف کننده از ادامه ظهور جلوگیری می شود. این محلول عموماً محتوی اسیداستیک و یک آمین است که pH آنرا به ۷ برساند. تثبیت نهایی تصویر ژل با شستن کامل آن در آب بدست می آید.

عموما" از ظروف شیشه ای یا ظروف دردار پلی اتیلن برای رنگ آمیزی نقره استفاده می شود. ظروف پلاستیکی هرچند ارزانتر هستند ولی تمیز کردن آنها سخت تر است. همچنین بسیار باید مراقب بود که خراشیده نشوند چراکه این خراشها مخزن نقره خواهند شد و در رنگ آمیزی اختلال ایجاد خواهند کرد. باقیمانده نقره را به سادگی می توان از این ظروف پلاستیکی توسط یک پارچه نرم آغشته به اتانل پاک کرد. اگر این روش کافی نبود می توان با محلول احیا کننده Farmer رنگ را به سادگی پاک نمود. ترکیبات این محلول عبارتند از : ۱/۰ درصد کربنات سدیم ، ۳/۰ درصد هگزاسیانوفرات[III] پتاسیم، و ۶/۰ درصد تیوسولفات سدیم . در انتها شستن جعبه با آب و اتانل این پروسه را کامل می کند.

مواد مورد استفاده در این روش بطور کلی باید دارای رتبه استاندارد pro-analysis باشند:

آب باید بوسیله رزین های تعویض یونی خالص شده باشد و با داشتن مقاومت بیشتر از پانزده مگااهم بر سانتیمتر (>۱۵MΩ/cm) دارای کیفیت مناسب باشد. استفاده از آب مقطر می تواندهمراه با نتایج غیرقابل پیش بینی باشد.

از محلول ۴۰%-۳۷ فرمالدئید استفاده می شود. این محلول در دمای اتاق تا ماه ها پایدار است. نگهداری این محلول در دمای ۴ درجه سانتیگراد منجر به پلیمریزه شدن و رسوب آن می شود.

تیوسولفات سدیم بصورت محلول ۱۰% وزن به حجم  (w/v) پنتاهیدراتِ تیوسولفات سدیم در آب مورد استفاده قرارمی گیرد. مقادیر کمی از این محلول مثلاً ۱۰ میلی لیتر، بصورت هفتگی تهیه و در دمای اتاق نگهداری می شود.

گلوتارآلدئید : بصورت محلول ۵۰% خریداری میشود و در دمای ۴ درجه سانتیگراد تا ماه ها نگهداری می شود. گلوتارآلدئید مورد استفاده باید از کیفیت خوبی برخوردار باشد اما درهرحال استفاده از نوع Microscopy-grade آن لزومی ندارد. از محلول های زرد رنگ آن نباید استفاده کرد.

اتانل ۹۵% را می توان بدون هیچ محاسبه حجم بکار برد و نیز نیازی به اتانل خالص نیست. استفاده از الکل های تقلیبی (denatured) توصیه نمی شود.

محلول۲ مولار اسیدسیتریک را می توان تهیه و تا ماه ها در دمای اتاق نگهداری کرد.

محلول استات پتاسیم : غلظت ۵ مولار تا ماهها در دمای اتاق قابل نگهداری است.

محلول یک نرمال نیترات نقره (Fluka) از پودر آن ارزانتر است و تا ماهها در یک ظرف تیره در یخچال قابل نگهداری است.

محلول یک نرمال هیدروکسیدسدیم به کار می رود.

محلول ۵ نرمال هیدروکسید آمونیوم را می توان تهیه و در یخچال نگهداری کرد.

برای رنگ آمیزی هر ژل ، حجم محلول مورد استفاده در هر مرحله باید حداقل پنج برابر حجم ژل باشدبه طوریکه محلول کاملا" ژل را بپوشاند. تعدادی از پروتکلهایی که می توانند مورد استفاده قرار بگیرند در ذیل ملاحظه می شوند

۶-۳-۱-۱-   رنگ آمیزی نقره آمونیاکی

محلول فیکساسیون که عبارتست از ۲۵% حجمی اتانل و ۴% حجمی فرمالدئید.

محلول حساس کننده حاوی ۰۵/۰ درصد (w/v) ۲-۷ نفتالن دی سولفات دی سدیم محلول نقره آمونیاکی که به این صورت تهیه می شود: ۴۸۰ میلی لیتر آب درون یک فلاسک ریخته می شود و با همزن مغناطیسی شدیدا" مخلوط می شود.. سپس به آن به ترتیب ۵/۷ میلی لیتر محلول یک نرمال هیدروکسید سدیم ، ۵/۷ میلی لیتر محلول ۵ نرمال هیدروکسید آمونیوم و ۱۲ میلی لیتر محلول یک نرمال نیترات نقره افزوده می شود. درحین افزودن محلول نیترات نقره یک رسوب قهوه ای بطور گذرا پدیدار می شود که باید ظرف چند ثانیه ناپدید شود. محلول مورد استفاده باید کاملاً شفاف باشد. این محلول برای رنگ آمیزی ۴ ژل کوچک کافی است.

محلول ظهور حاوی یک میلی لیتر محلول ۳۷% فرمالدئید و ۱۸۰ میکرولیتر اسید سیتریک۲ مولار در یک لیتر می باشد .

محلول توقف حاوی بیست میلی لیتر اسیداستیک و ۵ میلی لیتر اتانل آمین در لیتر است.

این روش مبنی بر روش Eschenbruch و Bürk است که در کلیات آن تغییراتی ایجاد شده است. برای حصول نتایج مطلوب تغییراتی باید در سطح قالب ریزی ژل ایجاد شود. بدین ترتیب که بجای استفاده از بیس اکریلامید از پیپرازین دی اکریلامید (PDA) استفاده می شود. همچنین تیوسولفات نیز در مرحله پلیمریزاسیون به ژل افزوده می شود. درعمل ، سیستم آغازگر متشکل از یک میکرولیتر TEMED، ۱۰میکرولیتر محلول ۱۰% تیوسولفات سدیم و ۱۰ میکرولیتر محلول ۱۰% پرسولفات آمونیوم به ازای هرمیلی لیتر از مخلوط ژل می باشد. این مقادیر متضمن شکل گیری صحیح ژل و حداقل رنگ زمینه درطی رنگ آمیزی می باشد.

بعد از الکتروفورز ، روش رنگ آمیزی نقره به شرح زیر انجام می شود :

• قالب ژل را بازکنید و ژل را ۵ تا ۱۰ دقیقه در آب بشویید.
• ژل را یک ساعت درمحلول فیکس کننده قراردهید

•  دو مرحله پانزده دقیقه ای ژل را درآب بشویید.

• ژل را در محلول حساس کننده از شب تا صبح قراردهید.
• شش مرحله بیست دقیقه درآب بشویید.
• درمحلول نقره آمونیاکی بمدت ۳۰ تا ۶۰ دقیقه قراردهید.
• شش تا بیست دقیقه در آب بشویید.
• ژل را درمحلول ظهور ظاهر کنید.
• ظهور را با محلول توقف خاتمه دهید. ژل را نیم تا یک ساعت در این محلول قرار دهید.
• پیش از خشک کردن یا دانستیومتری ، ژل را چندبار با آب بشویید.

 

۶-۳-۱-۲- محلول های مورد نیاز برای روش رنگ آمیزی نقره سریع :
 

محلول فیکس : ۵% اسیداستیک ، ۳۰% اتانل

محلول حساس کننده : ۲ میلی لیتر محلول ۱۰% تیوسولفات سدیم در لیتر.

محلول نقره : ۷/۰ میلی لیتر محلول ۳۷% فرمالدئید و ۵/۱۲ میلی لیتر محلول یک نرمال نیترات نقره در لیتر.

محلول ظهور : ۳۰گرم کربنات پتاسیم خشک ، ۲۵۰ میکرولیتر محلول ۳۷% فرمالدئید و ۱۲۵ میکرولیتر محلول ۱۰% تیوسولفات سدیم در لیتر.

محلول توقف : ۴۰گرم تریس و ۲۰ میلی لیتر اسیداستیک در لیتر.

این پروتکل براساس روش Blum و همکاران که در آن تغییراتی داده شده است, انجام می شود.

• ژل را ۳ تا ۳۰ دقیقه درمحلول فیکس کننده قراردهید.
• ژل را با آب ۲ بار و هر مرتبه ۱۰ دقیقه بشویید.
• برای حساس کردن ژل آنرا یک دقیقه درمحلول حساس کننده قرار دهید.
• ۱ دقیقه در آب قرار دهید.
• حداقل ۳۰ دقیقه در محلول نقره قراردهید.
• ژل را ۵ الی ۱۵ ثانیه در آب بشویید.
• تصویر را درمحلول ظهور ظاهر کنید. این مرحله ۱۰ الی۲۰ دقیقه طول می کشد .
• ظهور را به مدت ۳۰ الی ۶۰ دقیقه با محلول توقف خاتمه دهید.
• ژل را پیش از خشک کردن یا دانسیتومتری چندبار با آب بشویید.

 

۶-۳-۱-۳- رنگ آمیزی نقره ژلهای دارای فیلم نگهدارنده:

محلول فیکس : ۵% اسیداستیک ، ۳۰% اتانل

محلول حساس کننده : ۵/۰ مولار استات پتاسیم ، ۵/۰ درصد گلوتارالدئید ، ۲۵% اتانل و ۳ گرم در لیتر تتراتیونات پتاسیم (نکته ۱۰ و ۱۱ را ببینید).

محلول رنگ آمیزی نقره : ۵/۰ میلی لیتر فرمالدئید ۳۷% و ۵/۱۲ میلی لیتر محلول نقره یک نرمال در یک لیتر محلول.

محلول ظهور : ۳۰گرم کربنات پتاسیم خشک ، ۲۵۰ میکرولیتر محلول ۳۷% فرمالدئید و ۱۲۵ میکرولیتر محلول ۱۰% تیوسولفات سدیم در لیتر.

محلول توقف : ۴۰گرم تریس و ۲۰ میلی لیتر اسیداستیک در لیتر.

در این روش تنها در هر ظرف می توان یک ژل را رنگ آمیزی کرد.

ژل را فیکس کنید (۳*۳۰ دقیقه).

ژل را ۳۰ الی ۶۰ دقیقه درمحلول حساس کننده قراردهید .

در آب بشویید (۱۵ * ۴ دقیقه ).

بمدت ۵ الی ۱۰ ثانیه با آب بشویید ( نکته ۸ را ببینید).

با استفاده از محلول توقف ظهور بمدت ۳۰ الی ۶۰ دقیقه ظهور را متوقف کنید.

پیش از خشک کردن یا دانسیتومتری از ژل چندبار آنرا در آب بشویید.

نکته ها :

تفاوت در پروتکل های مختلف رنگ آمیزی نقره یا مربوط به زمان هرمرحله و یا در ترکیب محلولهای هرمرحله هستند. تغییرات عمده در ارتباط با غلظت معرف نقره، یا ماهیت و غلظت محلول حساس کننده می باشند. تنها موارد معدودی از مقایسه پروتکل های رنگ آمیزی نقره منتشر شده اند . از میان این مقایسات ، پروتوکل های منتخب در بخشهای قبلی ارائه شدند. انتخاب یک پروتوکل به امکانات آزمایشگاهی یک آزمایش و نیز به نیازهای آزمایشگر (سرعت ، قابلیت تکرار و غیره ) بستگی دارد. رهنمود های زیر را می توان در این رابطه پیشنهاد کرد :

• حداکثر حساسیت از یک روش به روش دیگر تفاوت گسترده ای ندارد. تفاوتها اصلی در یکنواختی رنگ آمیزی از یک پروتئین به پروتئین دیگر ، قابلیت تکرار در رنگ آمیزی ، سرعت روش، و انطباق آن بر پروتکل های مختلف ۲-D است.
• بطور کلی، روشهایی که در آنها از نقره آمونیاکی استفاده میشود نتایج بسیار یکسانی بدست می دهند و آثار رنگی (Color Effects) آن حداقل هستند و بنابراین برای ژلهای ۲-D که در آنها از محدوده وسیع pH استفاده می شود بسیار توصیه می شوند. با این وجود ، این روشها دارای نقصهای کوچکی هستند که مانع استفاده عمومی آنها می شود.
• معرف نقره نسبت به غلظت آمونیاک بسیار حساس است. از آنجا که آمونیاک بسیار فرار است باعث مشکلاتی در تکرار پذیری این روش در طی زمان می شود. با استفاده از محلولهای آمونیاک تیترشده تجارتی می توان تا حدود زیادی این مشکلات را برطرف نمود.

• نقره آمونیاکی با تمام سیستم های ژلهای SDS سازگار نیست. سیستم هایی که در آنها از Tricine یا Bicine بعنوان یون دنبال کننده استفاده می شود با رنگ آمیزی نقره آمونیاکی سازگار نیستند.
• رنگ آمیزی نقره آمونیاکی برای ژلهایی که فیلم نگهدارنده دارند توصیه نمی شود. در چنین مواردی آینه های نقره ای در ژل مکرراً مشاهده می شود.
•  پروتکل های مناسب برای رنگ آمیزی نقره آمونیاکی عموماً زمانبر هستند. بعلاوه ، با استفاده از ژلهای دست ساز ( غیرخریداری ) که در آنها از PDA بعنوان اتصال جانبی  و نیز از تیوسولفات در مرحله پلیمریزاسیون استفاده شده است نتایج مطلوب تری بدست می آید. این موضوع مانع استفاده از ژلهای تجارتی می شود. بعلاوه این پروتوکلها زمانی بهترین نتایج را بدست می دهند که از آلدئیدها ( فرمالدئید یا گلوتارالدئید ) بعنوان فیکس کننده و یا حساس کننده استفاده شود. ولی این مواد مانع از بازیافت پروتئین های رنگ آمیزی شده با نقره برای استفاده های بعدی مثلاً در Mass Spectrometry می شود.

۶-۴-      رنگ آمیزی  فلئورسانس

رنگ آمیزی با رنگ های فلئورسانت, نظیر SYPRO Ruby روشی بهینه شده برای آشکارسازی پروتئین ها در الکتروفورز دو بعدی است. این رنگها با تجارب مربوط به پروتئومیکس بسیار سازگار هستند. حساسیت رنگ SYPRO Ruby قابل مقایسه با رنگ امیزی نقره است و بر خلاف نیترات نقره دارای محدوده ی دینامیکی گسترده ای است. به همین دلیل امکان تعیین کمیت و اندازه گیری دقیق را می دهد. رنگ آمیزی با SYPRO Ruby   با روشهای طیف سنجی جرمی نیز سازگار است.

تغییری هوشمندانه در الکتروفورز دوبعدی با استفاده از رنگ های فلئورسانس موجب ابداع روشی جدید به نام الکتروفورز ژل افتراقی^[۳] یا DIGE  شده است. در این روش پروتئین ها در هر یک از دو نمونه مورد مقایسه با رنگ فلئورسانس متفاوتی برچسب گذاری می شوند. سپُ آنها بر روی یک ژل تفکیک می شوندو با آشکارسازی تفاوت بین دو نمونه مورد مقایسه قرار می گیرد. از این طریق اختلاف ناشی از استفاده از ژل های متعدد از بین می رود.

 

۷- کیفیت ژلهای ۲DE

ظرفیت تفکیک کنندگی ژلهای الکتروفورز دوبعدی بستگی به طول جداسازی در هر دو بعد دارد و معمولاً متناسب با کل مساحت ژل که درحین جداسازی در دسترس است درنظرگرفته می شود .

با استفاده کردن از ژلهای IPG  ۱۷ سانتی متری استاندارد و ژلهای SDS-PAGE ۲۰ سانتیمتری می توان  حدود ۲۰۰۰ پروتئین را در یک مخلوط پروتئین پیچیده مثل مخلوطهای لیزشدة بافتی یا لیز کامل سلولی, به سهولت از همدیگر تفکیک کرد. با استفاده از قالبهای ژلهای کوچک (مینی ژل)فقط چندصد پروتئین می توانند از همدیگر جدا شوند (شکل ۷-۱). اما کارکردن با این فرمتها بسیار راحت تر انجام می شود و برای غربالگری سریع بسیار مناسب است. برای بدست آوردن بالاترین و حداکثر قدرت تفکیک مورد نیاز برای مخلوطهای پروتئینی بسیار پیچیده, ژلهایی با فرمتهای بسیار بزرگ می توانند مورد استفاده قرار گیرند که در این صورت می توانند بین ۰۰۰/۱۰-۰۰۰/۵ پروتئین را از محلولهای  لیز سلولی از همدیگر جداکنند. به هرحال مزایای خاصی در استفاده کردن از ژلهای IPG که چندین محدوده pH را با همدیگر می پوشانند برای استفاده از یک نقشة پروتئینی ترکیبی از نمونه های پیچیده وجود دارد.

۷-۱-      تکرارپذیری الکتروفورزدوبعدی

تا گذشتة نه چندان دور تکرارپذیری مشکل اصلی محدودیت استفاده گسترده از الکتروفورز دوبعدی بود . استفاده از ژلهای لوله ای کلاسیک که در روش اوفارل (O'ffarel) معرفی شده بود معمولاً جداسازیهای تکرارپذیر را بسیار مشکل می کرد که حتی این کار در مورد یک نمونة مخصوص در داخل یک آزمایشگاه بسیار مشکل بود ، درحالی که مقایسة جداسازی الکتروفورز دوبعدی در آزمایشگاه های مختلف بسیار پراهمیت تلقی می گردد. استفاده کردن از ابزار ۲DE مشخص کمک شایان توجهی به حل این مشکل نموده است. در این وضعیت می توان تعداد بسیار زیادی از ژلهای ۲DE را بطور همزمان انجام داد و در این حال شرایط تکرارپذیری را قابل کنترل کرد.

مهمتر از آن مطالعات بین آزمایشگاهی نمونه های مختلف نشان داده است که الکتروفورزدوبعدی با استفاده از IPG تکرارپذیری بسیاربالایی را نشان می دهد.

۷-۲-      جلوگیری از ایجاد رگه های افقی و عمودی در ژلهای الکتروفورز دوبعدی

به عنوان اصلی کلی و فراگیر می توان اظهار داشت که بروز رگه های افقی به علت عدم فوکوسینگ کامل و بهینه ی پروتئینها در بعد اول الکتروفورز و پدیداری رگه های عمودی ناشی از جداسازی ناقص پروتئینها در بعد دوم الکتروفورز است.

۷-۲-۱- دلایل بروز رگه های افقی و روش های جلوگیری ازآن

استفاده از ولت ـ ساعت اضافی در بعد اول- همیشه برای رسیدن به تفکیک بهتر نیاز به استفاده از دورة فوکوسینگ طولانی تر نیست. چون همین وضع می تواند منجر به بروز رگه های افقی شود. بعضی از نمونه های پروتئینی نسبت به سایر پروتئینها فوکوسینگ آسان تری دارند. بنابر این برای هر نمونه ولت ـ ساعت مناسب به صورت تجربی تعیین می شود.

فوکوسینگ ناکافی در بعد اول الکتروفورز - فوکوسینگ ناکافی نیز رگه های افقی ایجاد می کند. بنابراین باید از مناسب بودن کل ولت - ساعت که برای طول و محدودة pH در هر نوار IPG استفاده می شود, اطمینان حاصل کرد. فوکوسینگ بیش از اندازه برای یک نمونه، یا انجام IEF  همزمان برای نوارهای IPG  با محدودة pH متفاوت در در یک سینی فوکوسینگ خود عاملی برای فوکوسینگ ناکامل پروتئینها است.

استفاده از پروتئین زیادی - مقدار کل پروتئینی که به IPG  منتقل می شود به طول IPG و روش رنگ آمیزی برای دیدن نتایج بستگی دارد. البته نکات جانبی مهمی را باید درنظر داشت. به عنوان مثال، وقتی از نمونة پروتئینی خاصی استفاده می شود که دارای یک نوع پروتئین بافراوانی زیاد است، مانند آلبومین سرم که ۹۰%-۷۰ کل پروتئین سرم را تشکیل می دهد, در صورت بارگیری به اندازه ی معمول, حضور انواع دیگر پروتئینها تحت الشعاع آلبومین قرار می گیرد. برای مقابله با این وضعیت باید از بارگیری بیشتر نمونه اجتناب نمود و در عوض با روشی مناسب آلبومین را حذف کرد. بکاربردن پروتئین اضافی در بارگیری رگه های افقی را بدتر می کند. بارگیری زیاد پروتئین در پیاله بارگیری - درحین بارگیری با پیاله یا مقدار زیاد نمونه باعث تجمع پروتئینها می شود و این مسأله منجر به رسوب پروتئین در نقطة ایزوالکتریک می شود که خود عاملی برای ایجاد رگه های افقی است.در این حال افزایش جزئی در حجم دهیدراتاسیون (تا ۱۰%) فوکوسینگ را بهتر می کند.

مشکلات آماده سازی نمونه - هر ماده ای که دارای بار الکتریکی باشد می تواند IEF را تحت تأثیر قرار می دهد و به بروز رگه های افقی منجر شود. آلودگی های شایع ، نمک، دترژنت، اسیدنوکلئیک، لیپید و یا ترکیبات فسفوریک هستند. رسیدن سریع شدت جریان به جریانی که از قبل تعیین شده است (معمولا" ۵۰ میکروآمپر به ازای هر نوار) در اوایل و در ولتاژی پایین, نمایانگر وجود آلودگی های یونی در نمونه است. در صورتی که  میزان ولت ـ ساعت برای حذف آلودگی یونی و در عین حال فوکوس شدن پروتئینها کافی نباشد, ولتاژهای پایین تر منجر به IEF طولانی و ظهور رگه های افقی می شوند. به هر فوکوسینگ طولانی نیز می تواند به داغ شدن بیش از حد نوار IPG و سوختن آن منجر می شود. آسانترین راه برای حل این مشکل ، کاهش قدرت یونی نمونة پروتئینی است. اگر مشکل نمک موجود در نمونه باشد، نمونه باید نمک زدایی شود. دترژنتهایی با شارژ مشخص مانند SDS می توانند پروتئینها را بپوشانند و به شدت شارژ پروتئینها را تغییر دهند و در نتیجه نقطة ایزوالکتریک آنها را تحت تأثیر قرار داده و رگه های افقی ایجاد کنند.   
آلودگی نمونه با اسید نوکلئیک نیز رگه های افقی ایجاد می کند. تعداد زیادی از پروتئینها با اسیدنوکلئیک باند می شوند و مجموعه هایی از پروتئین اسیدنوکلئیک ایجاد می کنند که به شدت نقطة ایزوالکتریک را تغییر می دهند. اسیدهای نوکلئیک را می توان با مجاور کردن نمونه با نوکلئاز قبل از IEF حذف کرد. با روش دیگری، اسیدهای نوکلئیک را با استفاده از اولتراسانتریفوژ درحضور اسپرامین می توان خارج کرد.  
پلی ساکاریدهایی که حاوی اسید سیالیک هستند شارژ منفی داشته و می توانند رگه های افقی شبیه اسیدهای نوکلئیک ایجاد کنند. پلی ساکاریدهای بدون شارژ نیز می توانند از طریق بستن سوراخهای ژل, از وارد شدن نمونه به درون IPG, رگه های افقی ایجاد کنند و فوکوسینگ را مختل می کند. گاهی اولتراسانتریفوژ برای حذف کربوهیدراتها کافی است.       
 به علاوه کاربامیلاسیون پلی پپتیدها در بعضی پروتئینها ایجاد شارژ ناهمگون می کند و نقاط مجزایی ایجاد می کند، تحت شرایط خاص مانند زمانی که از محدوده pH وسیع استفاده می شود به دنباله دار شدن نقاط منجر میشود. نمونه های پروتئینی باید با استفاده از اورة کاملاً خالص تهیه شوند و بیش از ۳۰ درجه سانتیگراد حرارت نگیرند.    
آخرین علت بروز رگه های افقی مربوط به تهیه نمونه، وجود باندهای دی سولفید است. زمانی که پیوندهای  دی سولفید قبل ازالکتروفورز دو بعدی و به اشکال بین مولکولی و داخل مولکولی در پروتئین های محلول  ایجاد می شوند ، اشکال متفاوت پروتئینی ایجاد می شوند که اختلاف اندکی در pI پروتئینها ایجاد می کند. در ژل ۲D به شکل پهن شدن یک نقطه تنها دیده می شوند. مولتی مرها یی از پروتئینهای مشابه‌ ، به شکل نقاط دنباله دار، نقاط فانتوم ، نقاط از تخریب شده ظاهر می شوند.

 

حلالیت کم پروتئین - اشکال در حل شدن کامل همة پروتئینها در یک نمونه، باعث بروز رگه های افقی می شود. علاوه بر استفاده از ترکیبات کائوتروپ و دترژنت ها برای افزایش حلالیت, سانتریفوژ کردن قبل از IEF و حذف کمپلکسهای پروتئینی حل نشده راهی مناسب برای حل این مشکل است.

 

جریان الکترو اندواسمیک - یکی از مشکلات در IEF پروتئینهای بازی جریان الکترواندواستمیک است که به علت حرکت آب از کاتد به آند، رگه های افقی ایجاد می کند. جریان آب می تواند باعث کند شدن حرکت پروتئینها در مسیر مخالف شود و در نتیجه فوکوسینگ کامل انجام نشود. بعلاوه خشک شدن IPG در کاتد ، قطر سوراخهای ژل را در آن ناحیه کاهش می دهد در نتیجه حرکت پروتئین کندتر شده و فوکوسینگ کامل نمی شود. همچنین خشک بودن IPG باعث تجمع پروتئین می شود و رگه های افقی را بوجود می آورد. با استفاده از جاگذاری Paper wick در انتهای کاتد و آغشته به آب و استفاده از گلیسرول, ایزوپروپیل الکل یا متیل سلولز به محلول نمونه وبافر خیساندن این مشکل مرتفع گردیده است.

۷-۲-۲- دلایل بروز رگه های عمودی و روش های جلوگیری ازآن

 حلالیت کم پروتئین - درطی جداسازی بعد اول، تمام پروتئینها به طرف نقطة ایزوالکتریک خود حرکت می کنند و هیچ شارژ مشخصی ندارند. قدرت یونی
شبکه ی ژلی، خیلی کم استبه همین دلیل یونهای کوچک همگی از ژل IEF خارج می شوند. پروتئینها تحت این شرایط حلالیت کمی دارند و همه در ژل ماتریکس علیرغم حضور دترژنتها، عوامل کائوتروپ و دیگر افزودنیهای حلال رسوب می کنند. هدف اصلی از مرحلة متعادل سازی بعد از IEF  پوشاندن این پروتئینها با SDS بوده که با دادن شارژ منفی به آنها مجدداً این پروتئینها حل شده و آنجا وارد ژل بعد دوم شوند.

 

بارگیری زیاد پروتئین - وقتی که مقدار زیادی پروتئین بارگیری می شود و یا زمانی که محتوی پروتئینی نمونه فراوانی زیادی دارد, ممکن است حل کردن مجدد پروتئینها در مرحلة متعادل سازی کامل انجام نشود. در نتیجه رگه های عمودی ایجاد می شود و بیشتر نقاط پروتئین دنباله دار خواهند بود. این مشکل را می توان با بارگیری کمتر پروتئین در ژل بعد اول مرتفع ساخت.

فوکوسینگ بیش از اندازه - با افزایش زمان فوکوسینگ رسوب ایزوالکتریک اتفاق می افتد که منجر به رگه های عمودی می شود بنابراین با جلوگیری از فوکوسینگ بیش از حد می توان از رگه های را کاهش داد.

متعادل سازی غیرمؤثر - متعادل سازی باید به گونه ای انجام شود که اطمینان کامل از نفوذ SDS و حلالیت پروتئنها حاصل گردد. سینی متعادل سازی باید حرکت کند تا از حرکت محلول روی ژل مطمئن باشیم. اگر نیاز باشد می توان زمان متعادل سازی را تا ۴۵ دقیقه افزایش داد. البته احتمال دارد از این طریق بعضی پلی پپتیدهای کوچک ( کمتر از KD۱۵ ) از دست برود اما حذف پروتئینهای بزرگتر حتی با متعادل سازی طولانی ناچیز است.      
غلظت SDS باید حداقل ۲% باشد, بویژه اگر غلظت دترژنت استفاده شده در بعد اول بیش از ۲% بوده است.   
دیگر ترکیبات محلول متعادل سازی نیز حائز اهمیت هستند. محلول استفاده شده باید بافر شود بویژه اگر یک مرحلة قلیایی بکار گرفته می شود زیرا استفاده از آیودواستامید تولید اسید می کند. بهترین تامین کننده ی pH مطلوب برای متعادل سازی, گلیسرول است که باید با غلظت حداقل ۲۰% در محلول موجود باشد گلیسرول یکی از ترکیبات مهم محلول متعادل سازی است و کمبود آن ایجاد رگه های عمودی می کند.

اکسیداسیون پروتئینها -         باید در تمام مراحل الکتروفورز دوبعدی از اتصال متقاطع اکسیداتیو (اکسیداسطون گروهای نیول آزاد) و تاخوردگی مجدد پروتئینها ممانعت به عمل آورد. اکسیداسیون پروتئین درطول جداسازی بعد دوم می توان رگه های عمودی را ایجاد کند. برای جلوگیری از اکسیداسیون مجدد گروههای سولفیدریل آزاد  سیستئین باید آنها را آلکیله کرد. الکیلاسیون می تواند قبل از IEF صورت گیرد. اگر نمونه الکلیله نباشد الکلیلاسیون باید در مرحلة دوم متعادل سازی با یدواستامید ۵/۲%  انجام شود.

کیفیت ضعیف مواد یا اشتباه در تهیه محلول ها - رگه های عمودی و دیگر مشکلات دربعد دوم از کیفیت ضعیف مواد و اشتباه در ساخت محلولها نیز بوجود می آید. باید در استفاده از مواد با کیفیت خوب دقت شود و از درست بودن pH تمام بافرها اطمینان وجود داشته باشد. ژلهای بعد دوم از قبل آماده شده باید قبل از تاریخ انقضاء استفاده شود. اکریلامید با کیفیت پائین و محلول ذخیرة آکریلامید قدیمی به علت پلیمریزاسیون ناکامل در بعد دوم رگه های عمودی ایجاد می کند. اگر از بافر مصرف شده ی تانک الکتروفورز در SDS-PAGE مجدداً استفاده شود، جداسازی ضعیف بوده و رگه های عمودی به علت کاهش یونها و SDS ایجاد می شود.

• جای گذاری نادرست نوار IPG روی ژل بعد دوم - رگه های عمودی در اثر ایجاد فاصله بین نوار IPG و ژل بعد دوم نیز می توانند ایجاد شوند.سطح رویی ژل بعد دوم باید کاملاً صاف باشد. سطح بالای ژل تراز بوده و باید نوار IPG در تمام طول در تماس مستقیم با ژل بعد دوم باشد. نوار IPG در هنگام جاگذاری نباید خم شود و از این مسأله با اطمینان از چسبیدن لبة پلاستیکی آن به لبة فوقانی ژل بعد دوم می توان جلوگیری کرد. اضافه کردن آگارز از شل شدن نوار IPG و حرکت آن جلوگیری می کند. حبابهای هوا در آگارز ریخته شده باید حذف شوند.
• ظهور منافذ با اندازه های مختلف در نوار IPG به دنبال IEF - بعد از جداسازی در بعد اول ممکن است ضخامت نوار IPG متفاوت می شود. تورم یا نازک شدن بعضی از قسمتها در ژل به علت حرکت آب در ژل است. در نواحی نازک تر اندازه ی سوراخ های ژل کوچکتر و حرکت پروتئین خارج ژل به داخل و رسیدن به نقطة ایزوالکتریک را کاهش می دهد و یا حتی جلوگیری می کند و این مسأله رگه های عمودی ایجاد می کند. در موارد شدیدتر ، پروتئینها به علت گیرکردن در IpG کاملاً از بین می روند. حرکت آب در طی بعد اول جداسازی را می توان از طریق حذف کامل نمک از نمونه و جلوگیری از فوکوسینگ بیش از اندازه کاهش داد.

• ۸- آنالیز تصویری
• روشهای متفاوت در آشکارسازی ژل های الکتروفورز دو بعدی به فنون تصویربرداری خاص خود نیاز دارند. این فنون باید قادر به تشخیص علائم کروموژنیک مختلف و علائم فلورسانت باشند برای این منظور از دستگاه های مختلفی چون اسکنر اسناد Document scanner, دوربین CCD Charged -coupled device camera, و دانسیتومترهای لیزری استفاده می شود.
• با توجه به تعداد نقاط بسیار زیاد ةاهر شده بر روی ژل الکتروفورز دو بعدی, بهترین روش آنالیز با استفاده از کامپیوتر صورت می پذیرد. با استفاده از ابزار کامپیوتری می توان حتی نقاط کمرنگ را تشخیص داد و تعیین اندازه کرد, تصاویر ژل های متفاوت را با یکدیگر مقایسه نمود و تغییرات کمی بیان پروتئین ها را در ژل های تهیه شده از یک نمونه در شراطی متفوت را مشخص نمود. چندین نرم افزار مطرح برای چنین کاربردی در بازار موجود است:Z۳ ساخت Compugen, Melanie V از Genbio و Amersham و PD Quest از BioRad. تمامی این نرم افزارها ابتدا تصویر ژل را در برنامه نشان می دهندو قادر به ویراستن تصاویر در قالب TIFF هستند. سپس این نرم افزارها به تشخیص نقاط می پردازند, اطنکار به صورت خودکار صورت گرفته و قابلیت ویراستاری دستی را دارند. با تنظیم نحوه ی تشخیص نقاط می توان این نحوه را برای یک سری از ژلها اعمال کرد. بعد از این مرحله نرم افزارها شروع به تطابق نقاط یکسان بر روی یک سری از ژل های مورد نظر و انتخاب شده می نمایند. اولین مرحله در این کار تعیین یکی از ژل ها به عنوان ژل مرجع است. در ژل مرجع چندین نقطه ی پروتئینی به عنوان نقاط اصلی به منظور پیدا کردن جفت های یکسان آنها بر روی ژل های دیگر تعیین می شوند. سپس تطابق نقاط جفت شروع می شود. با انجام این مرحله نطابق کل نقاط ژل ها شروع خواهد شد. بعد از این مرحله ویراستاری و تصحیح دقیق تطابق های انجام شده صورت می گیرد. این مرحله برای افزایش دقت در مقایسه بین ژل ها ضروری است. یکی از توانایی های این نرم افزارها امکان ایجاد ژلهای مصنوعی یا ژلهای میانگین Average gels با استفاده از ژلهای تطابق یافته حاصل از یک نمونه در یک وضعیت مشخص است. این ژلهای میانگین برای بررسی تغییرات در بیان پروتئین در بین دسته های مختلف ژلها بسیار کار آمد هستند.
• برخی مواقع در تصاویر ژلهای الکتروفورز دو بعدی اختلاف در شدت نقاط ناشی از اختلاف در بیان پروتئین ها نیست, بلکه اختلاف در آماده سازی نمونه, میزان بارگیری, نحوه ی رنگ آمیزی و حتی تصویر برداری موجد این اختلاف است. درچنین مواردی نرم افزار ها قادر به نرمالیزه کردن تصاویز برای جبران این اختلاف در شدت نقای هستند. اینکار توسط رجوع به نقاطی می شود که از عدم تغییر در میزان آنها در طی آزمایشهای مختلف اطمینان وجود دارد.
• در نهایت آنالیز اطلاعات شروع خواهد شد. در ابتدا نقاطی نشان داده می شوند که برای آنها ویژگی خاصی تعریف شده باشد, مثلا" نقای تطابق یافته ای که بیش از دو برابر اختلاف در ژلهاژ مقایسه شده دارند. وقتی که گروه خاصی از نقاط انتخاب شدندتغییرات در شاخص های نقاط, مثلا" دانسیته نوری یا حجم نقای, به صورت هیستوگرامهایی نشان داده خواهند شد. گزارش های آماری حاوی پارامترهای آماری نظیر میانگین ها, انحراف معیار و واریاسیون ایجاد می شود. و آمارهای ساده ای چون آزمونStudent's t-test نیز در این نرم افزار ها اجرا می شوند.

- چشم انداز

جداسازی مخلوط های پروتئینی پیچیده با قدرت تفکیکی و قابلیت تکرارپذیر بالا, برای انجام موفقیت آمیز پروتئومیکس بسیار پراهمیت است. در سالیان اخیر ترکیب الکتروفورز دو بعدی, طیف سنجی جرمی, و ابزار بیوانفورماتیک در مقیاس بسیار وسیعی برای تحقیقات پروتئومیکس به کار گرفته شده است. با استفاده ی گسترده از الکتروفورز دو بعدی, محدودیت های این روش به تدریج مشخص شده اند. این محدودیت ها عبارتند از:

• با این روش نمی توان پروتئوم را به طور کامل آنالیز کرد. پروتئین های ظاهر شده بر روی یک ژل فقط نماینده قسمتی از تمام پروتئین های موجود در نمونه هستند. به طور کلی آن پروتئین هایی که در ژل ظاهر می شوند پروتئین هایی با فراوانی بالا در نمونه هستند. پروتئین هایی که در تعداد نسخه های کم حضور دارند با روشهای رنگ آمیزی موجود نمایان نمی شوند.
  علاوه بر این پروتئین های بسیار بزرگ, بسیار کوچک, بازی و پروتئین های هیدروفوبیک نیز در شرایط معمول آشکار نمی شوند. یکی از مشکلات اصلی در الکتروفورز دو بعدی پروتئین های غشایی با هیدروفوبیسیته بسیار زیاد هستند که در روشهای محلول سازی رایج به صورت محلول در نمی آیند.
• دقت تعیین مقدار کمی نقاط به خصوص در رنگ آمیزی نقره زیاد نیست, چرا که محدوده ی دینامیک این رنگ آمیزی وسیع نبوده و همینطور خصوصیت رنگ پذیری پروتئین ها با یکدیگر متفاوت است. کوماسی آبی برای اندازه گیری مقدار پروتئین ها مناسب تر است اما حساسیت آن کم است.
• اتوماتیک کردن آین روش بسیار سخت است و به همین دلیل روشی با ظرفیت آنالیز زیاد نیست.

برای رفع این محدودیت ها, روشهای ابداعی زیادی برای الکتروفورز دو بعدی ایجاد شده است. برای مثال استفاده از دترجنتهای قوی تر, جزء به جزء کردن نمونه, استفاده از IPG  با محدوده ی pH باریک, رنگ های فلورسانت و حتی روباتها برای بریدن و هضم آنزیمی ژل ها. به علاوه  پیشرفتهای زیادی نیز در ابداع و توسعة روشهایی جایگزین برای جداسازی پروتئینها در پروتئومیکس بدست آمده است, اما هنوز هیچکدام نتوانسته اند جایگزین قابل رقابتی برای الکتروفورز دوبعدی باشند. دلیل این امر خصوصیات ویژه ی این روش است که عبارتند از:

• غنای اطلاعات نهفته در داده های بدست آمده از الکتروفورز دو بعدی - اطلاعات مختلفی از نقاط ظاهر شده بر روی ژل الکتروفورزبدست می آید. از جمله نقطه ی ایزوالکتریک, وزن مولکولی و کمیت نسبی آن. در ترکیب با طیف سنجی جرمی هر نقطه را می توان تعیین هویت و ویژگی نمود. با توجه به ظهور چندین صد نقطه بر روی یک ژل به حجم زیاد این اطلاعات می توان پی برد.

• امکان جداسازی و تعیین پروتئین هایی با تغییر بعد از ترجمه - در اغلب مواقع, پروتئین هایی که بعد از ترجمه تغییر یافته اند به صورت دسته نقاطی که به صورت یک توده عمودی یا افقی هستند در ژل الکتروفورز دو بعدی ظاهر می شوند. این پروتئین های تغییر یافته به سهولت با طیف سنجی جرمی قابل تشخیص هستند.
• قابلیت تفکیک زمانی و مکانی مراحل آنالیز پروتئوم - می توان الکتروفورز دو بعدی را در یک آزمایشگاه تحقیقاتی انجام داد و بعد از انتخاب نقاط پروتئینی مورد علاقه, آنها را در زمانی دیگر در مرکزی خدماتی, تعیین هویت کرد. به علاوه ژلهای خشک شده ی الکتروفورز دو بعدی را می توان سالها نگاهداری کرد و سپس با طیف سنجی جرمی آنالیز نمود. بدین ترتیب می توان بایگانی کم حجم و پر ارزشی را در اختیار داشت.

 

• سهولت و ارزانی نسبی - انجام آن در مقایسه با دیگر روشها از سهولت بسیار بیشتری بر خوردار است و اغلب آزمایشگاه ها با تکنیک های رایج الکتروفورز یک بعدی آشنایی دارند. همچنین قیمت تجهیزات و مواد در مقایسه با دیگر روشها بسیار ارزانتر است.

به هر حال پیشرفت های اخیر به شدت توانایی های الکتروفورز دو بعدی را برای آنالیزر پروتئوم افزایش داده است و به نظر می آید فعلا", و البته تا آینده ای نه چندان دور, الکتروفورز دو بعدی تکنیک اصلی در جداسازی پروتئین ها در پروتئومیکس باقی بماند 

Brown TA (۲۰۰۱)Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction. Blackwell Scientific Publication , Oxford .

Primrose SB, Twyman RM ,Old RW (۲۰۰۱) Principles of Gne Manipulation ,۶th edn. Blackwell Scientific Publication , Oxford .

برگرفته از «http://fa.wikipedia.org/wiki/%D8%A7%D9%84%DA%A9%D8%AA%D8%B1%D9%88%D9%81%D9%88%D8%B1%D8%B2»