تشخیص توکسوپلاسموز

الف: مشاهده توکسوپلاسما در نسج بیوپسی شده (با روش ایمونوسایتوکمیکال )

ب : تلقیح نسج الوده ( بیوپسی یا نمونه تهیه شده در اتوپسی ) به حیوانات آزمایشگاهی حساس

ج : بررسی های ایمنولوژیک آنتی بادی اختصاصی یا آنتی ژن در سرم و مایعات بدن

بیوپسی غدد لنفاوی و بررسی تغییرات هیستوپاتولوژیک مشخص آن یکی از روش های مفید در تشخیص بیماری است. با روش های رنگ آمیزی متداول ، ارگانیسم عامل بیماری به ندرت در نسج دیده می شود اما با استفاده از رنگ آمیزی فلورسنت آنتی بادی در برخی موارد انگل مشاهده شده است .

آزمون های سرولوژیک در تشخیص توکسوپلاسموز:

سابین – فلدمن ( Dye-test) ، ثبوت مکمل ، هماگلوتیناسیون غیرمستقیم و فلورسنت آنتی بادی غیرمستقیم رایج ترین آزمون های سرولوژیک برای تشخیص توکسوپلاسموز هستند در زمان حاضر آزمون الایزا نیز به عنوان یک روش حساس مورد استفاده قرار می گیرد. برخی از روش های سرولوژیک (به خصوص CF و IHA ) به دلیل نیاز به آنتی ژن محلول ، ممکن است به طور ضعیف مثبت ویا حتی منفی باشند و لذا در تشخیص توکسوپلاسموز مادرزادی مفید واقع نمی گردند. تشخیص توکسوپلاسموز حاد براساس روشهای سرولوژیک با مشاهده عیارهای بالارونده آنتی بادی تاییدمیشود زیرا ممکن است عیار آنتی بادی برای سالها پس از عفونت حاد بالا باقی بماند و تشخیص بیماری تنها براساس یک آزمایش سرولوژیک قطعی نیست.

-2آزمون سابین- فلدمن :

چنانچه ارگانیسم های زنده به دست آمده از اگزودای صفاق موش را برای یک ساعت در37درجه و در مجاورت سرم طبیعی نگهداری کنند انگلها متورم شده و با آبی قلیائی شدیدأ رنگ می گیرند.این پدیده اساس آزمون سابین- فلدمن را تشکیل میدهد. انگلهایی که سرم حاوی  آنتی بادی در شرایط قبل به آنها اضافه گردد چروکیده و کوچک گشته ، در اثر عمل آنتی بادی و مکمل لیز می شوند و رنگ آبی متیلن را به خود نمی گیرند.

انجام این آزمایش نیاز به سیستم مکمل- پروپردین دارد و لذا از سرم انسان یا خوکچه هندی به این منظور استفاده می گردد. عیار گزارش شده غلظتی از سرم است که در آن نیمی از ارگانیسم ها کشته نشده (رنگ گرفته ) و نیمی دیگر نابود شده اند (رنگ ناپذیر).تشخیص این دو نوع ارگانیسم با کمک فاز میکروسکوپ به آسانی انجام پذیر است.به دلیل نیاز به ارگانیسم زنده برای  انجام آزمون ، خطر ابتلای پرسنل ازمایشگاه وجود دارد و لذا باید دقت کافی به کار رود.

براساس توصیه سازمان بهداشت جهانی می توان عیار  DT رابرحسب واحد بین المللی در میلی متر مکعب سرم در مقایسه با یک سرم استاندارد شده رفرانس ( 2IU=1:8 ) گزارش نمود.

معمولا یک یا دو هفته پس از عفونت توکسوپلاسمائی عیار DT به آهستگی افزایش می یابد و اغلب دو ماه یا بیشتر طول می کشد تا به حداکثر میزان خود برسد. این حداکثر اغلب معادل یا بیشتر از 300 واحد بین المللی / میلی مترمکعب (معادل یا بیشتر از 1:1000)است و میتواند تا حد 3000 واحد بین المللی / میلی مترمکعب (برابر یا بیشتر از 1:10000)باشد.عیار بالای آنتی بادی برای ماهها یا سالها در خون وجود دارد و در برخی موارد تا 12 سال پس از مرحله حاد عفونت میزان بیش از 3000 واحد بین المللی گزارش شده است. در اکثر موارد پس از گذشت 4تا6ماه عیار آنتی بادی به آهستگی کاهش پیدا می کند و پس از آن در یک حد معین (1:64 تا 1:4) برای تمام عمر مثبت باقی می ماند.

Dye Test      3  :

در انسان معمولأ اختصاصی است و موارد مثبت کاذب به دلیل واکنشهای متقاطع نادر است. در عفونت ناشی از سارکوسیستیس آزمون سابین – فلدمن مثبت می شود اما با استفاده از آزمون ثبوت مکمل می توان عفونت توکسوپلاسمائی را تشخیص داد.

در برخی افراد پس از تزریق خون ( به دلیل حضور آنتی بادی ها در خون شخص اهداء کننده ) موارد مثبت کاذب DT گزارش گردیده است. در چنین مواردی عیار آنتی بادی پائین بوده و در عرض چند ماه نیز آزمون منفی می گردد( 13).

-4آزمون  هماگلوتیناسیون غیرمستقیم :

 در این روش گلبولهای سرخ حساس شده با آنتی ژن توکسوپلاسما با اضافه کردن سرم حاوی آنتی بادیهای ضد توکسوپلاسما، آگلوتینه می شوند.

آنتی بادی  در این آزمایش چندین روز دیرتر از آنتی بادیهای مربوط به  DT ظاهر میشود و میتواند عیار آن تاحد آزمایش قبل بالا رود و ضمنا برای زمان طولانی تری در حد بالا باقی می ماند.

از انجا که آنتی بادیهائی که با روش هماگلوتیناسیون ، ثبوت مکمل یا الایزا تشخیص داده میشوند معمولا در زمان طولانی تری نسبت به آنتی بادیهای DT در سرم ظاهر می گردند لذا ارزش کمتری در تشخیص عفونت حاد دارند. این آزمون ها نقش مهمتری در نشان دادن مرحله عفونت دارند بخصوص وقتی که امکان تکرار یک ازمون سرولوژیک در بیمار نباشد.  IHAدر اغلب موارد توکسوپلاسموز مادرزادی منفی بوده است و لذا برای تشخیص انواع مادرزادی بیماری توصیه نمی گردد. واکنشهای متقاطع بین توکسوپلاسما و Besnoitia jellisoni در روش هماگلوتیناسیون غیرمستقیم و ثبوت مکمل گزارش شده است(35).

-5آزمون ثبوت مکمل :

آنتی بادیهای ثبوت مکمل به طور عمده در توکسوپلاسموز اکتسابی مطالعه شده است.این آنتی بادیها دیرتر از آنتی کورهای مربوط به DT ظاهر میشوند و در مواردی که عیار آزمون ایمونو فلورسانس و یا DT از قبل بالا و ثابت باشد می تواند مفید واقع شود. یک آزمون ثبوت مکمل منفی که بعدامثبت گردد و یا عیار بالا رونده همراه با عیار بالا وثابت DT نشانه یک عفونت فعال است. این آزمون ممکن است چند سال پس از ابتلا به عفونت منفی گردد و در برخی موارد برای ده سال نیز مثبت باقی مانده است. عیار این آزمایش 1:16 تا 1:256 متغیر می باشد.

از آنجا که آنتی بادیهائی که با روش هماگلوتیناسیون, ثبوت مکمل یا الایزا تشخیص داده می شوند معمولا در زمان طولانی تر

نسبت به آنتی بادیهای DT در سرم ظاهر میگردند لذا ارزش کمتری در تشخیص عفونت حاد دارند. این آزمونها نقش مهمتری در نشان دادن مرحله عفونت دارند به خصوص وقتی که امکان تکرار یک آزمون سرولوژیک در بیمار نباشد.(36)

IHA در اغلب موارد توکسوپلاسموز مادرزادی منفی بوده است و لذا برای تشخیص انواع مادرزادی بیماری توصیه نمی گردد.

-6آزمون پرسی پیتین:

روش دیفوزیون دوبل در آگار ژل با استفاده از سرم بیمار یا مایع داخل چشم در تشخیص برخی از موارد توکسوپلاسموز چشمی و یا توکسوپلاسموز حاد منتشر در بیمارانی که به اختلال سیستم ایمنی دچارهستند ارزشمند است(37).

 9آزمون آگلوتیناسیون فولتون:

اکنون به صورت تجارتی وجود دارد. این آزمایش به آنتی بادیها از نوعIgM بسیار حساس است. امکان پیداش آگلوتیناسیون غیر اختصاصی در افراد سالم وجود دارد.

-10آزمون فلورسنت آنتی بادی غیر مستقیم(IFA):

 گر چه اکثر محققان برای این آزمون ارزشی معادلDT  از نظر اختصاصی بودن قائل هستند ولی واکنش های مثبت کاذب در برخی از سرم ها که حاوی آنتی بادیهای ضد هسته باشند مشاهده می گردد. به این دلیل در بیمارانی که به اختلالات نسوج همبندی(لوپوس منتشر یا آرتریت روما توئید) مبتلا هستند علاوه بر انجام آزمون ایمونوفلورسانس برای تائید وجود بیماری از DT یا IHA باید استفاده شود.

عیار آنتی بادی به هیچ عنوان ارتباطی با شدت بیماری ندارد و در کسانی که نشانه های بالینی ندارند ممکن است عیار آنتی بادی به بیش از 1/25600  نیز برسد. عیار آنتی بادی می تواند برای سالها بالا باقی مانده و سپس تدریجا کاهش یابد.

باید توجه داشت که در هر دو روش DTوIFA بسته به آزمایشگاهی که آزمون در آن انجام می شود پاسخ ها می تواند متفاوت باشد.

آزمایش IgM فلورسنت آنتی بادی روشی حساس برای تایید تشخیص توکسوپلاسموز اکتسابی حاد یا مادرزادی است. به دنبال عفونت اکتسابی عیار IgM سریعا افزایش می یابد و به 1:160 یا بیشتر نیز می رسد.لذا عیار 1:160 یا بیشتر مثبت تلقی می گردد اما باید توجه داشت که عیارهای کمتر نیز احتمال وجود عفونت فعال را رد نمی کند و در تعدادی از آزمایشگاهها عیار 1 یا بیشتر را در بالغان و بیش از 1:2 در نوزادان مثبت تلقی می نمایند. وجود فاکتور روماتوئید موجب می شود که آزمایش به طور کاذب مثبت شود

11روش الایزا((ELISA:

از حساسترین روش های تشخیصی است. آنتی بادیهای ضد هسته و فاکتور روماتوئید در این آزمایش ایجاد اختلال و پاسخ های مثبت کاذب نمی کنند.